BrdU細胞增殖檢測試劑盒樣本準備要求

描述：BrdU檢測試劑盒用于細胞和組織切片的細胞增殖檢測。BrdU(5-Bromo-2-deoxyUridine)，即5-溴脫氧尿嘧-啶核苷，是胸腺嘧啶核苷(T)類似物，檢測原理為BrdU可以通過競爭替代胸腺嘧啶核苷T摻入DNA合成期(S期)。當處于旺盛分裂的細胞摻入BrdU后，利用抗BrdU抗體和抗體連接酶或熒光素作為指示系統(tǒng)，即可檢測出含有BrdU的細胞，結(jié)合其它細胞標記物進行雙重標記，可判斷出增殖細胞的種類、增殖速度等，對研究細胞動力學有重要意義。BrdU經(jīng)活體注射或細胞培養(yǎng)時進入組織細胞，摻入DNA定位準確，可有效反應S期細胞新合

成DNA的水平，而且受細胞內(nèi)外環(huán)境影響小，標記不會丟失。

細胞樣品：

1. 細胞準備：提前準備細胞爬片，確保細胞狀態(tài)正常，貼壁良好；

2. BrdU孵育：細胞經(jīng)含BrdU的培養(yǎng)基于培養(yǎng)箱中避光孵育一定時間，BrdU濃度及細胞孵育時間依據(jù)細胞種類不同，建議預實驗摸索最佳條件。注意事項中已測試細胞實驗條件可供參考；

3. 細胞固定：上述經(jīng)BrdU孵育的細胞爬片，PBS洗3次，每次5min。向孔板內(nèi)加入1mL 4%多聚甲醛覆蓋細胞，室溫固定20-30min。PBS洗3次，每次5min；

4. 通透：向孔板內(nèi)滴加破膜液覆蓋細胞處理8-10min，PBS洗3次，每次5min；

5. 細胞核染色（可選）：

若后續(xù)白光檢測，則用蘇木素染細胞核：向孔板內(nèi)滴加蘇木素染液室溫染色5min，吸棄蘇木素染液，PBS洗3次，每次5min；

若后續(xù)熒光檢測，則用DAPI染細胞核：向孔板內(nèi)滴加DAPI染液室溫染色5min，吸棄DAPI染液，PBS洗3次，每次5min；

6. 再固定：向孔板內(nèi)滴加4%多聚甲醛室溫孵育10min，PBS洗3次，每次5min；

7. 酸化：向孔板內(nèi)滴加1M HCl覆蓋細胞，37℃處理10min，PBS洗3次，每次5min；

8. 后固定：再次向孔板內(nèi)滴加4%多聚甲醛室溫孵育10min，PBS洗3次，每次5min；

9. 封閉：向孔板內(nèi)滴加封閉液（3% BSA）室溫孵育30min。吸棄封閉液，不要清洗；

10. Anti-BrdU抗體孵育：向孔板內(nèi)滴加anti-BrdU一抗工作液覆蓋細胞，4℃孵育過夜。吸棄anti-BrdU一抗工作液，PBS洗3次，每次5min；

11. 二抗孵育：向孔板內(nèi)滴加二抗工作液覆蓋細胞，室溫孵育1h。吸棄二抗工作液，PBS洗3次，每次5 min。注意，若是用熒光標記的二抗，孵育及洗滌時均需避光；

結(jié)果觀察

如果用HRP標記的二抗檢測，細胞核呈深藍色，增殖細胞呈棕色。如果是熒光標記的二抗，細胞核呈藍色熒光（Ex=358 nm，Em=461 nm），增殖細胞為對應二抗的熒光。

注意事項

1. 對于細胞爬片樣品，BrdU的使用濃度和處理時間與細胞種類有關。一般來說，處理腫瘤細胞所需濃度和時間都較低，成纖維細胞或上皮細胞等增殖較慢的細胞需要提高濃度并延長作用時間，建議濃度范圍為20-100μM，作用時間為40min-4h，可根據(jù)具體細胞的種類進行摸索調(diào)整。

下表為測試的常用細胞處理濃度及時間，僅供參考。